Технологія рекомбінатних ДНК
Найважливішим досягненням останніх років стало впровадження метод генетичної інженерії, чи, точніше, технології рекомбінантних ДНК. Ці методи полягають у формуванні окремих ділянок ДНК людини, що містять окремі гени або їх певні послідовності. З цією метою використовують ферменти, які називаються рестриктази. Вони послідовно розщеплюють ДНК на окремі ділянки. Наприклад, фермент Eco RI (фермент розщеплення) відокремлює G від А у послідовності — GAATTC —, таким чином утворюючи "липкі" кінці, які так називаються через те, що вони зв'язуватимуться з подібними послідовностями, що виробляються цим же ферментом на ДНК з відповідним вектором:
Вектор, на якому відбувається з'єднання ділянок, як правило являє собою плазміду — маленьке кільце ДНК. Це рекомбінантна частина процесу. Далі вектор потрапляє до мікмікроорганізму, здебільшого до Escherichia coli, з якого розвивається культура, що формує клони з великою кількістю копій ДНК людини. Клоновану ДНК можна позначити за допомогою 32 Р, а потім її використовувати як пробу. Проба — це позначений однонитковий фрагмент ДНК, який буде схрещуватися, й внаслідок цього вказувати та розміщувати (шляхом ауторадіографії) комплементарні послідовності серед фрагментів ДНК на саузернблоті (мал. 1.3). Цей процес — це перенесення фрагментів ДНК, що були відокремлені за допомогою електрофорезу від гелю агарози на нітроцелюлозний фільтр, де вони здатні схрещуватися з пробою (злиття двох однониткових ДНК шляхом поєднання відповідних основ).
мал. 1.3ЗАСТОСУВАННЯ У МЕДИЦИНІ
Описані вище методи широко застосовуються у медицині. Особливе значення має синтеза біологічно важливих молекул (інсулін людини, гормон росту, фактори системи зсідання крові) та діагностика генетичних захворювань. Остання можлива завдяки проведенню генної аналізи , яка полягає у дослідженні клонованої та поміченої послідовности ДНК, що співвідноситься з частиною гена, який відповідає за виникнення того чи іншого розладу. Ця метода проілюстрована на мал. 1.4 стосовно антенатальної діагностики гемоглобінозів.
мал. 1.4Поліморфізм, що викликаний обмеженнями довжин рестрикційного фрагменту ДНК
Для використання специфічних генних проб необхідно мати якомога більше даних про властивості хворого гена. Та при багатьох розладах їх виявити неможливо. Тому дослідження хворих генів треба проводити іншими методами. У цьому випадку діагностика залежить від доказу того, що ушкоджений ген приєднаний до маркера ДНК (на тій самій хромосомі чи коло неї), або від виявлення поліморфізму внаслідок обмеженням довжини рестрикційного фраґменту ДНК. Поліморфізми довжин рестрикційних фрагментів — це зміни у послідовностях ДНК, які виникають в усьому геномі і не впливають на організм людини. Вони є наслідками або втрати місця обмеження довжини, або набуття такого нового місця. Отже, фраґменти, що сформовані відповідним рестрикційним фрагментом, у різних людей мають різні розміри, і їх можна виявити завдяки різноманітній моторності на саузерн - блоті. Поліморфізми довжин рестрикційних фрагментів успадковуються як звичайні генетичні ознаки (мал. 1.5). Якщо вдається довести, що ген, який викликає захворювання, тісно пов'язаний з поліморфізмом довжин рестрикційного фрагменту, можна впровадити методу виявлення гена, що викликає захворювання, не маючи взагалі ніякої інформації про цей ген. Протягом кількох останніх років вчені відкрили багато подібних зв'язків, які зумовлюють різноманітні розлади, їх можна застосовувати для виявлення розладів аутосомної домінанти до з'яви симптомів хвороби у здорових Жінок — носіїв Х-зчеплених розладів, доклінічного обстеження, а також для проведення антенатальної діагностики.
мал. 1.5